09月22日, 2014 222次
1、RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成
2、miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制
miRNA的功能很多研究证明 miRNA是通过参与调节其下游基因翻译过程面发挥其生物学功能。比如，Lai等观察到果蝇miR-2a、miR-2b、miR-6、miR-11、miR-13a及miR-13b等的5'端6~8nt序列具有一定的关联性，它们均可与K框(Kbor)的相同序列互补K框是作为负调控果蝇增强子断裂( enhancer split)复合体基因的3'UTR序列中的保守基因序列。对于一些带有K、GY或Brd框的基因(GY和Brd框是类似于K框的其他基因3'UTR中的控制元件)，可以被 miRNA识别并与之碱基配对。其实，基于 MIRNA作用机制，可将其分成两个区域，其5'端的核苷酸代表了“姓”( family)区域，该区域匹配这些框中的一个，而其他的区域类似“名”( forename)，特异白匹配特定的靶，在动物中，单个mRNA可识别多个mRNA靶标，一个mRNA靶标可被多个 miRNA识别。根据 miRNA保守的5'端“种子”顺序同源性搜索分析，推测人类基因组中约三分之二的蛋白质编码基因受 miRNA的调控。已知所有动物 miRNA作用的mRNA靶点均在其3＇UTR。
miRNA的作用机制miRNA对靶基因的作用机制一直是众多研究人员的关注热点。最早被发现的两个miRNA ——lin4和let-7被认为是通过不完全互补结合到基因mRNA 3' UTR，以一种未知的方式抑制蛋白质翻译，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译过程。后来的研究也发现，多个果蝇 miRNA和它们的基因mRNA的 3' UTR 存在部分同源。但由于 miRNA与其目标靶之间的互补是不完全的，用生物信息学的方法鉴定 miRNA的目标位点并非易事。在植物中，由于 miRNA与潜在的基因是完全互补的，使得植物的miRNA预测相对较容易。但这些预测基因是否就是 miRNA的靶基因，还需要作进一步验证。
研究表明， miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其与基因的作用模式不同，主要可分为以下3种类型：
①作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与 siRNA非常类似，最后切割mRNA，常见于植物。
②作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻止翻译而不影响mRNA的稳定性，这是目前发现最多的作用模式，常见于动物。(如下图)
（图一)
③具有以上两种作用模式，当与标基因完全互补结合时，直接向切割mRNA，当与标基因不完全互补结合时，阻止基因翻译。（如上图） miRNA对基因的调控，正如前文所述(一文读懂miRNA的生物合成)， Pre-miRNA由 exportin-5输出至胞浆中，然后释放 Pre-miRNA. Pre-miRNA与Dicer互补结合，产生长度为22nt的不完全配对的双链RNA。最后，双链中只有一条单链与RNA诱导的RISC结合，随后与把mRNA互补。而 miRNA*释放后则被降解。对于 miRNA来说，发挥对靶基因的调控作用， Dicer和RISC是必不可少的。因为 Dicer是产生 miRNA不可或缺的，而RISC则是 miRNA实现功能的载体。
1、RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成
2001年， Elbashir等在《基因发育》杂志( Genes Devolopment)发表一篇文章，介绍了在果蝇体外系统中加入合成21~23nt的 siRNA，使之能有效降解同源mRNA他们发现当siRNA浓度增加到一定阈值时，mRNA降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi所需蛋白因子。这些RNAi所需蛋白因子是一种复合物，被定义为RNA诱导的沉默复合体(RISC）。研究发现，RISC是一种核糖核蛋白，主要由RNA和蛋白质成分组成。其中的RNA即是siRNA，而蛋白质成分主要为AGO22、VIG、dFXR以及Dmp68等，并且，这些蛋白质成分是组成RISC所必须的，并参与RNAi过程。 miRNA介导的RISC简称为 miRISC( miRNA-containing RNA induced silencing coplex)，也被称作 miRNA核糖核蛋白复合体( miRNP)。miRISC复合体除了包括成熟 miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其他相关蛋白。其与RISC结合的原理与siRNA类似，通过miRNA: miRNA*双体两端热力学稳定性的分析，可以分为两类结合：优势结合与等势结合。以 dsRNA为例，当双链中两根支链的稳定性相似或相同时，它们结合进入RISC的概率也相似或相同，因此称为等势结合（如图一所示）。当双链中支链的稳定性相对较弱时，解旋会从稳定性弱的一支解开dsRNA，从而会偏向性地产生一条结合到RISC复合体上，这类结合称为优势结合，未进入RISC的互补链RNA会很快降解(如图二所示)。
(图二）
RISC是 miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体。在 miRISC复合体中， Dicer对Pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联进行的。通常，只有一条链进入 miRISC，具体选择双链中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性等因素。不进入RISC的 miRNA链被称之为伴随链( passenger)，并被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。但在某些情况下，两条链均具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能 miRNA。RISC是具有多轮催化效应的酶。在这一过程中，其核心组分Ago2发挥重要作用。因此，在组成 miRISC的蛋白质中，Ago蛋白家族成员在RISC功能中处于中心地位，Ago蛋白家族在哺乳动物中有8种，分为Ago和PIWI两个亚家族。人Ago亚家族有四种: hagol-4；PIW亚家族有HIWI、HILI、 PIWIL3、HIWI2四种。果蝇有两种Ago蛋白，分别是Agol和Ago2。
(图三）
Ago家族蛋白为一类分子质量约为100kD的蛋白质，属于进化保守的家族，包含有PAZ和Piwi两个保守的RNA结合结构域，是目前唯一一种在所有RNAi和 miRNA通路中均可发现的蛋白。PAZ结构域负责结合引导链( guide) miRNA的3' 端突出的2个核苷酸或者单链RNA的3'-OH；PIWI结构域则负责组装核酶H( ribonuclease- H)，并与 miRNA 5＇端结合。Ago蛋白与 miRNA结合使其朝向正确，以便与靶基因mRNA作用。Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻译抑制功能;一些Ago蛋白直接切割靶转录本。（如图三所示）
Ago家族有不同的突变种和表型。研究发现，秀丽线虫有24个Ago蛋白，果蝇中有5个Ago蛋白，乳动物有8个同源蛋白Ago蛋白，所以RISC会呈现不同类型或者调控方式。根据Ago的不同，可以将RISC分为切割RISC与非切割RISC两类。对于一个特定的RISC是否切割一个mRNA分子，主要取决于以下几个方面：
目标mRNA的特性(主要包括分子结构及数量等)；RISC的类型必须为切割RISC；组织中，RISC的切割速度；miRNA与靶基因必须满足一定的匹配程度；miRNA的来源。在人基因组中含有的8个AgO蛋白中，有4个成员存在于所有乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/ hAgo；PIWI存在于精细胞和细胞中，RISC的其他组成分还包括人类免疫缺陷病毒活化反应RNA结合蛋( human immunodeficiency virus tran activating response RNA binding protein，TRBP)，干扰素诱导的蛋白激酶活化因子(wro rein activator of the interferon induced protein kinase，PACT)，运动神经元存活复合体( survival of motor neurons complex)，脆性X智障蛋白( fragile X mental retardation protin，FMRP)和 Tudor葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白( Tudor staphylococcal nuclease domain contining protein) 等。RISC的结构特征主要包含以下几个方面：(1)成熟的 miRNA与RISC结合。RISC含Dicr及其他蛋白质。RISC又称 miRNP，和 miRNA结合的RISC称为“ miRISC"。(2) Dicer 加工pre-miRNA与RNA双链解旋偶联，解旋的 miRNA只有一条单链保留在RISC中。(3) argonaute(Ago)是RISC的核心成分，为 miRNA诱导的基因沉默所必需。Ago含有两个RNA结合域：PAZ，与成熟 MIRNA的3' 端结合；PIWI，类似核糖核酸酶-H，和引导链5'端结合。两者共同将成熟 miRNA定向，使其和靶mRNA互补。（如图四所示）
（图四）
2、miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制 miRNA靶向互补 mRNAs导致目的mRNA切降解的过程被称为转录后基因沉默(ot ranscriptional gene silencing，PTGS)。有效的PTGS需要RISC对mRNA转录本的切割 。
miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达——mRNA的降解或翻译抑制。采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定的。如果mRNA能够与miRNA完全互补，该mRNA就会被RISC特异地降解；如果mRNA不能与 miRNA完全互补，仅在某个位点与 miRNA互补，那么RISC就不会特异地降解mRNA，只是阻止mRNA作为翻译的模板，使之不能合成蛋白质。在动物中，多数情况下复合物中的单链 miRNA与mRNA的 3' UTR不完全互补配对，从而阻碍对该mRNA的翻译，并以此来调控基因表达，但不影响mRNA的稳定性。如线虫中的 miRNA lin-4就是以这种方式调控它的两个靶基因——lin-14和lin-28的翻译。另一种主要的作用方式则与 siRNA诱导的转录后基因沉默的PTGS相类似，当 miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白可通过对mRNA的切割直接导致其降解，完成基因沉默调控。 此外， miRNA诱导的基因沉默还存在一些其他的方式，如 miRNA还能通过组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化影响基因的表达；miRNA与 5' UTR相互作用然后上调基因表达，由胞浆转运入核，以及近些年来发现的 miRNA能加速mRNA脱腺苷酸化( accelerated deadenylation)而抑制基因表达等多种作用模式。
miRNA诱导基因沉默的机制可以归纳为以下两个主要方面:(1) miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制 miRNA对翻译起始抑制的相关机制主要有如下一些观点：首先， miRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始，进而起到对翻译过程的抑制作用。miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子结构成为支持这一理论的重要依据，由此可以推断 miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而发挥作用；Ago2中间结构域具有结合m7G帽子的活性，Ago2通过 对miRNA招募靶mRNA的 3' UTR，从而与起始复合物eIF4E/G竞争性结合m7G帽子，最终发挥对翻译起始复合物的抑制作用。还有一些观点认为，通过影响靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致其 polyA尾缩短，从而使mRNA与 polyA结合蛋白( polya binding protein，PABP)受阻，进而影响蛋白质翻译的起始。
研究还表明，一些被 miRNA作用后的mRNA可以与多核糖体偶联，这些核糖体在翻译中处于非常活跃的状态。此外， miRNA的抑制作用还可能发生在翻译起始之后，这主要是由于其翻译过程的抑制作用是通过内部核糖体进入位点( internal ribosome entry site，IRES)什么是IRES，而不是依赖 MRNA m7G帽子来发挥作用。其他作用方式，比如对新生多肽链的翻译同步降解等目前还没有定论，有待进一步证实。
(2) miRNA介导的mRNA衰减(降解) miRNA可诱导与其不完全配对的犯mRNA衰减(降解)。通过Ago蛋白定位于如P小体( processing bodies，P- bodies)等的RNA颗粒( RNA granules)中，这些颗粒中包含有mRNA降解的酶。这也可能是 miRNA介导mRNA衰减的一个重要途径。
